Formålet med denne øvelse er at identificerer tre plasmider fra hinanden, ved at se på dets ”fingeraftryk”. Fingeraftrykket fremkommer ved at skære plasmiderne med restriktions enzymer som skærer DNA’et i mindre stykker.
De tre plasmider er alle sammen lavet i det samme gær-plasmid, men de indeholder forskellige gener. Alle plasmider indeholder genet GFP, men i to af plasmiderne er GFP blevet fusioneret til henholdsvis genet for ACA8 (et protein der pumper calcium rundt i cellen) og en muteret version af ACA8( ACA8.N).
Materialer
Varmeblok
Eppendorf-rør
6?l?buffermix
2?l plasmid DNA(a, b, eller c)
1?l Spel (3U/?l)
??l EcoRV (3U/?l)
Micro-centrifuge
Hansker
Pipetter
Elektroforese apparat
Fremgangsmåde
Til start blandes følgende i et eppendorf-rør:
6?l?buffermix
2?l plasmid DNA(a, b, eller c)
1?l Spel (3U/?l)
??l EcoRV (3U/?l)
For at blande væsken ordentlig sætter vi den i micro-centrifuge.
Prøverne sættes derefter ved 37grader i ca. 30min.
Derefter tilsættes 2?l farvet påsætnings-buffer (LBx6) til prøven.
Vi påsætter nu prøven i en ”brønd” i en 1% agarosegel i TBE buffer. Til slut køres vi gelen i ca. 20min v. 100V i gelelektroforese.
Forsøgsopstilling
Forsøgsopstilling til A1
Teori
Strukturen af GFP-molekylet 1
Tidligere var molekylærbiologi og bioimaging to videnskabsgrene, som lå langt fra hinanden. Opdagelsen af GFP ændrede dette. Faktisk indgik der også en helt tredje videnskabsgren, nemlig zoologi. I 1960’erne fandt zoologer ud af, at en vandmand fra havet fluorescerer når man belyser den med UV- eller blåt lys. Fluorescensen skyldtes et protein kaldet GFO, green fluorescens protein. GFP stammer fra vandmænd med navnet Aequora Victoria, der lever i havet ud for Washington, USA. Det lykkedes molekylærbiologer at isolere genet og i 1944 blev det for første gang udtrykt i andre organismer. Disse organismer kom herved også til at fluorescere.
Det er gratis at oprette en konto